L’ Analisi Isotopica in enologia

Questi metodi sono stati messi a punto a partire dall’inizio degli anni ’80 del secolo scorso da un gruppo di ricercatori dell’Università di Nantes, tra cui Gerard Martin, ed hanno avuto una grande applicazione in tutti i campi della ricerca alimentare, farmaceutica e anche enologica. 
Il loro grande sviluppo è legato anche all’introduzione di apparecchiature sempre più sofisticate e alla quasi totale mancanza di metodiche analitiche alternative.

La quantificazione del rapporto da due isotopi dello stesso elemento ha potenzialità notevoli nello stabilire se due oggetti chimicamente simili hanno provenienza diversa, in relazione alla differenza delle materie prime. 
Fenomeni di vario tipo influenzano la distribuzione isotopica degli elementi nelle materie prime, determinando differenze nei prodotti finali che possono essere rivelate dalle tecniche di analisi isotopica. 
Sono di particolare interesse gli isotopi stabili, cioè non artificiali. La tecnica che li determina si chiama Stable Isotope Ratio Analysis (SIRA).

La peculiarità che caratterizza questi metodi, è che permettono all’analista di identificare e quantificare molecole che hanno la stessa struttura chimica, ma che provengono da materie prime diverse o sono state elaborate con processi diversi, per esempio una sintesi biologica e una industriale. 
È possibile distinguere gli aromi naturali di frutta, la vanillina, da quelli di sintesi industriale, l’acido acetico prodotto dalla fermentazione acetica da quello di sintesi, i succhi di frutta, i salmoni selvaggi da quelli di allevamento tramite l’analisi di un lipide caratteristico. 

L’analisi degli isotopi stabili è molto importante soprattutto negli studi di autenticità degli alimenti.
Essa, sulla base dei differenti rapporto isotopici, permette di riconoscere molecole, presenti in alimenti, aventi la stessa struttura chimica ma provenienti da materie prime diverse o elaborate con processi diversi, per esempio per sintesi biologica o industriale. 
Si possono distinguere: 

• gli aromi naturali (es. vanillina) da quelli di sintesi 
• l’acido acetico proveniente dalla fermentazione acetica da quello ottenuto industrialmente 
• i salmoni selvatici da quelli di allevamento (in base ad un lipide caratteristico) 
• l’aggiunta di zuccheri diversi da quelli presenti naturalmente 
• l’annacquamento del latte 
• la provenienza geografica di alimenti

In enologia tali metodi vengono impiegati per la ricerca di alcune sofisticazioni: lo zuccheraggio, definito come l’aggiunta di zuccheri di natura diversa da quelli presenti nell’uva (barbabietola, canna da zucchero, mais e/o loro miscele) e l’annacquamento, definito come l’addizione illecita, di acqua e la pratica dello zuccheraggio-annacquamento. Inoltre si può stabilire anche la zona di provenienza di un vino. 
Un tempo la ricerca di questo tipo di frodi veniva fatta con metodi chimici poco riproducibili e quindi non permetteva di ottenere risultati di grande rilievo. Quindi l’introduzione dei metodi isotopici ha fornito un potente strumento per la ricerca delle sofisticazioni, soprattutto perché non è necessario effettuare il controllo a monte della produzione, ma è possibile effettuarlo sul prodotto finito, anche dopo molti anni. 

Per studiare i parametri isotopici, in enologia, vengono presi in considerazione i seguenti elementi chimici: l’idrogeno, il carbonio e l’ossigeno e i loro rispettivi isotopi stabili: l’ ¹H e l’ ²H (deuterio – D), il ¹²C e il ¹³C, l’ 1⁶O e l’¹⁸O. 
Le proporzioni degli isotopi stabili nei vari composti sono approssimativamente quelle medie esistenti sulla terra, tuttavia le piccole deviazioni dalla media sono la chiave per differenziare un campione dall’altro

I diversi isotopi reagendo fra loro formano molecole chimicamente uguali, ma isotopicamente diverse. È il caso delle molecole di acqua (H₂O) e di diossido di carbonio (CO₂) che si possono formare, differenziate dal punto di vista isotopico diventano: H₂¹⁶O, H₂¹⁸O, H-O-D, ¹²CO₂ , ¹³CO₂.
L’acqua e il diossido di carbonio che si formano hanno pesi molecolari diversi e la loro abbondanza è uguale a quella dell’isotopo dal quale si sono originate. In ugual modo succede per l’alcool etilico nella sua formazione per fermentazione naturale.

Successivamente queste molecole subiscono il cosiddetto frazionamento isotopico, che può venire riassunto in 3 fasi: atmosferico, fisiologico e biochimico. 
Quindi la possibilità di differenziare due campioni in base all’analisi isotopica è legata al fenomeno di frazionamento isotopico che avviene nelle materie prime, ovvero nella deviazione dalla distribuzione isotopica naturale degli elementi in conseguenza a fenomeni biogeochimici naturali. 
La variazione naturale di abbondanza isotopica è conseguenza delle diverse proprietà chimico-fisiche degli isotopi di uno stesso elemento.

Nel ciclo vegetativo delle piante, l’assorbimento di acqua dal terreno e il processo di traspirazione, caratteristico di ciascuna specie, causano anch’essi un arricchimento di isotopi pesanti (²H e ¹⁸O), in dipendenza dalla specie vegetale e dalle condizioni climatiche (climi freddi, piovosi o caldo-aridi).
Quindi, in dipendenza di questi parametri, le piante hanno a disposizione acqua “isotopicamente” diversa, da utilizzare nella fotosintesi.

Il cammino fotosintetico per la fissazione della CO₂ è la principale fonte di variazione. Le piante incorporano CO₂ secondo tre meccanismi biosintetici:

• il ciclo di Calvin o C3 (es. vite e barbabietola)
• il ciclo di Hatch-Slack o C4 (es. canna e mais) 
• il ciclo noto come Crassulean Acid Methabolism o CAM, meno comune. 

Il meccanismo C3 provoca un frazionamento del carbonio molto più elevato rispetto agli altri due meccanismi. Gli isotopi più pesanti, in questo caso il ¹³C, sono cineticamente meno favoriti e quindi più lenti a reagire, per cui, maggiore è il numero dei passaggi di reazione e tanto più sarà selettivo il processo.

Durante i fenomeni di evaporazione e precipitazione si verifica frazionamento isotopico dell’ossigeno.

L’entità del frazionamento dipende dalla temperatura, la quantità di umidità rimossa, il tipo di condensazione (conversione in acqua o in ghiaccio) e altri fattori climatici e geografici. 
Essendo il frazionamento dipendente dalla temperatura, dal punto di vista geografico il valore di ¹⁸O diminuisce: 

• all’aumentare della latitudine
• all’aumentare dell’altitudine

Al termine del ciclo sintetico si producono molecole di glucosio che hanno un contenuto isotopico correlato a quello dell’acqua e dell’anidride carbonica impiegate, nonché del ciclo fotosintetico seguito, ovvero nei diversi vegetali si producono zuccheri isotopicamente diversi, nel contenuto in Deuterio, ¹⁸O e ¹³C. 
È stato dimostrato che la fermentazione alcolica non cambia in modo significativo i rapporti isotopici ottenuti durante il frazionamento isotopico, per cui essi si ritrovano nelle molecole di alcol etilico prodotte.

Il parametro su cui si basa l’analisi isotopica è il rapporto isotopico, cioè l’abbondanza relativa di due isotopi dello stesso elemento. 
Per convenzione, il rapporto isotopico si indica sempre ponendo a numeratore un isotopo più pesante e a denominatore un isotopo più leggero.

I parametri isotopici presi in considerazione a fini analitici sono i seguenti: 

• Il Rapporto Isotopico (D/H)_I che è caratteristico della specie vegetale che ha sintetizzato lo zucchero, da cui l’alcol ha avuto origine, e in misura minore alla geografia del luogo (natura dell’acqua usata per la fotosintesi) determinato sperimentalmente mediante la Tecnica della Risonanza Magnetica Nucleare sul distillato ottenuto dal vino. 

• Il Rapporto isotopico ¹³C/¹²C che rappresenta la variazione ‰ rispetto a una sostanza di riferimento definita da organismi internazionali quali l’Agenzia Internazionale per l’Energia Atomica (IAIE) di Vienna, determinato mediante la Spettrometria di Massa dei Rapporti Isotopici sul distillato ottenuto dal vino. 

• Il Rapporto isotopico ¹⁸O/¹⁶O che rappresenta la variazione ‰ rispetto a un riferimento convenzionale del contenuto dell’acqua dell’Oceano (V-SMOW Vienna Standard Mean Ocean Water), misurato mediante la Spettrometria di Massa dei Rapporti Isotopici sul vino tal quale. In definitiva, i fenomeni naturali che si succedono durante il ciclo degli elementi C, H e O sono tali da permettere una differenziazione del prodotto finale. 

In base al tipo di rapporto isotopico in considerazione, si possono avere le informazioni descritte nella tabella.

Come è apparso sin dai primi anni di studi i parametri isotopici variano con il clima, la piovosità, la latitudine, quindi per ogni annata si hanno valori diversi. 
Ad esempio per il rapporto D/H nei vini italiani, a seconda della latitudine, del clima e della piovosità si possono avere valori compresi tra circa 98 e 107 ppm. Per questo è necessario, avere delle Banche Dati di riferimento comunitarie, di conseguenza venne a suo tempo varato un primo regolamento comunitario che prevedeva, in tutti gli stati membri, la costituzione delle banche dati isotopiche. 
Anche in Italia, in ottemperanza a quanto previsto dalla normativa comunitaria, sono state costituite, a partire dal 1987, col patrocinio del Ministero delle Politiche Agricole e Forestali – Ispettorato Centrale per la Qualità dei Prodotti Agroalimentari, le Banche Dati, su campioni sicuramente genuini e provenienti da tutte le regioni italiane. 
Ogni anno, vengono raccolti circa 400 campioni di uva e per ogni prelievo viene compilata una scheda che contiene le principali caratteristiche del vigneto e i dati relativi alla produzione (Kg per ceppo, resa per ettaro), eventuale irrigazione, piovosità. 

Le uve raccolte, vengono successivamente vinificate in laboratorio ottenendo il vino da analizzare. I vini vengono distillati e inviati ai laboratori competenti per essere analizzati. Per tutti i parametri isotopici, la Banca Dati italiana viene formalmente validata da una Commissione della Comunità Europea, che si avvale del contributo tecnico del Joint Reserch Center di Ispra (Va). 
Grazie a queste Banche Dati si può stabilire con certezza la genuinità di un campione di vino analizzato, e si può anche confrontarsi con i limiti regionali, per stabilire la zona di provenienza. 
A livello europeo, dal 1990 esiste un database di vini che raccoglie dati da campioni di provenienza certa vinificati in Europa, secondo le indicazioni del Regolamento UE 2676/90. 
Oltre ai dati dei valori D/H originariamente previsti, attualmente il database comprende anche valori di δ¹³C dell’etanolo e di δ¹⁸O dell’acqua di vino. 
Siccome le possibilità di adulterazione comprendono l’utilizzo di mosti rettificati, zuccheri e prodotti vari da paesi del terzo mondo, si stanno raccogliendo dati anche da vini provenienti da questi paesi

Le applicazione delle tecniche isotopiche in enologia sono: 

– Rivelazione aggiunta di zucchero esogeno. Dalla misura dei rapporti isotopici del deuterio e del carbonio, dell’alcol etilico, si sono ottenuti i seguenti risultati teorici:

Dalla variazione dei rapporti isotopici del deuterio è semplice risalire alla contraffazione dovuto allo zuccheraggio. Infatti, in base al rapporto isotopico D/H, la contraffazione dovuta all’addizione di zuccheri di canna o bietola è relativamente semplice da identificare: il valore dovuto allo zucchero presente naturalmente nel vino è 98-102 ppm; valori superiori indicano addizione di zucchero di canna e mais, mentre valori inferiori indicano addizione di zucchero di bietola. 
Valori superiori a 108 ppm, indicano senz’altro l’addizione di zucchero di canna da zucchero o mais, mentre valori inferiori a 95 ppm, indicano addizione di zucchero ricavato dalla barbabietola.
L’aggiunta di una miscela equivalente di zuccheri di canna e barbabietola non modifica il rapporto isotopico del deuterio, ma può essere facilmente evidenziata dall’aumentare del rapporto isotopico ¹³C/¹²C che passa da – 27 a – 19 (per miscele al 50%). 

– Annacquamento L’aggiunta di acqua al vino influenza il rapporto isotopico dell’ossigeno, in particolare diminuisce, in modo proporzionale alla quantità di acqua aggiunta. 
L’acqua di rubinetto ha un contenuto in ¹⁸O minore dell’acqua del vino e farà diminuire di conseguenza il valore del rapporto isotopico del vino analizzato. Quindi, anche in questo caso, dal confronto con i valori della Banca Dati è possibile stabilire se un campione di vino è stato addizionato di acqua di rete o meno. 

– Acqua e Zucchero La contemporanea aggiunta di acqua e zucchero modifica tutti i parametri isotopici. E quindi è facilmente rilevabile con l’associazione delle tre tecniche isotopiche. 

– Origine Geografica dei vini a DOP Per controllare l’origine geografica dei vini a DOP si utilizzano le Banche Dati Isotopiche annuali, che vengono effettuate tutti gli anni, suddivise per regione di provenienza. Il campione controllato deve rientrare nel range di valori, individuati dalla banca dati. Se non vi rientra significa che il prodotto analizzato potrebbe essere stato contraffatto o provenire da altra zona geografica.

Per la determinazione della provenienza regionale, si possono utilizzare gli stessi parametri utili a identificare le adulterazioni, cioè δ¹³C e δ18O di etanolo e acqua di vino. La base è ovviamente il database UE. 
Nella tabella successiva sono riportati i valori dei rapporti isotopici di idrogeno, carbonio e ossigeno misurati in vini provenienti dalle regioni italiane per l’annata 1994: 

• D/H e ¹³C/¹²C misurati nell’etanolo
• ¹⁸O/¹⁶O misurato nell’acqua

La determinazione è però resa problematica dal fatto che i campioni incogniti possono essere stati soggetti ad adulterazione, rendendo difficile la collocazione all’interno del database. 
Inoltre le variazioni stagionali naturali possono essere significative (figura sotto – δ¹⁸O di vini tedeschi della Franconia in annate diverse).

Una misura alternativa può essere la determinazione del rapporto isotopico dell’azoto (15N/14N) dagli aminoacidi, che però può essere influenzato dall’addizione di sali di ammonio per la fermentazione. 

Nella figura sotto sono mostrati i valori di δ¹³C e δ¹⁸O rilevati in vini di presunta produzione tedesca e ritenuti di pregio. In realtà, dal confronto con i dati del database UE sembra evidente che alcuni campioni sono miscele di vini tedeschi e vini provenienti dall’Europa meridionale.

L’approccio migliore sembra quindi essere un impiego di più variabili, sia isotopiche sia di altro genere. Un’alternativa all’analisi isotopica degli elementi leggeri è quella degli elementi pesanti, generalmente presenti negli alimenti in concentrazioni a livello di tracce (< 0.1%) .
Gli elementi in tracce negli alimenti hanno concentrazioni bassissime e dipendenti da fattori vari, tra cui l’origine geografica. 
Durante l’assunzione delle sostanze minerali da parte delle piante non si ha frazionamento isotopico significativo per gli elementi presenti in tracce nel terreno. Quindi, i loro rapporti isotopici sono eccellenti indicatori di provenienza o traccianti.
Per questo motivo, il collegamento degli alimenti con il terreno è studiato mediante l’analisi isotopica di elementi più pesanti, quali lo stronzio (Sr) e il piombo (Pb), che sono presenti nel terreno in quantità limitate.
Questi elementi hanno una distribuzione isotopica differente da terreno a terreno, che può agire da impronta digitale. Le principali applicazioni dell’analisi isotopica degli elementi pesanti si hanno in campo enologico. 
La concentrazione del nuclide ⁸⁷Sr aumenta gradualmente col tempo nei minerali, a differenza degli altri isotopi di Sr.  Quindi, il rapporto ⁸⁷Sr/⁸⁶Sr tende ad aumentare in maniera relativamente a tempi geologici. 
Dal punto di vista della tracciabilità, quel che più conta è che il rapporto ⁸⁷Sr/⁸⁶Sr  varia a seconda dell’età geologica del terreno e quindi a seconda dell’area geografica. Terreni molto antichi avranno valori più alti di questo rapporto, mentre terreni geologicamente giovani avranno valori più bassi. 
In definitiva il nuclide ⁸⁷Sr agisce da tracciante. L’impiego degli isotopi dello stronzio come marcatori nel vino è stato introdotto da ricercatori tedeschi nel 1992. 
Il rapporto ⁸⁷Sr/⁸⁶Sr  può essere utilizzato come tracciante dell’origine del vino se esiste una correlazione significativa tra il valore di questo rapporto nel terreno e nel vino e se esistono differenze significative tra vini di differente provenienza geografica. 
Naturalmente, occorre verificare se la distribuzione isotopica di Sr rimane inalterata nel trasferimento di sostanze nutrienti dal terreno alle piante e nei vari passaggi della filiera del vino. 
Se così fosse, la distribuzione isotopica nel vino dovrebbe riflettere quella del terreno da cui si originano le viti. Nella figura sono riportati i valori di ⁸⁷Sr/⁸⁶Sr  per vini da tavola (T) e vini fortificati (R) provenienti da alcune regione vinicole:

Il risultati indicano che vini provenienti da regioni diverse hanno valori di ⁸⁷Sr/⁸⁶Sr statisticamente differenti, e quindi il parametro isotopico può costituire una promettente impronta digitale dell’origine del vino. 
Nella tabella qui sotto sono riportati i valori di ⁸⁷Sr/⁸⁶Sr per vini di regioni diverse.

Si noti come vini provenienti da suoli basaltici (più giovani geologicamente) abbiano valori minori di vini provenienti da suoli granitici (più antichi).
 Altri risultati di determinazione di ⁸⁷Sr/⁸⁶Sr in vini di regioni diverse.

Le potenzialità dell’analisi isotopica sono tali che nel corso degli ultimi anni alcuni metodi di analisi sono diventati ufficiali al livello nazionale ed europeo. 

– Regolamento CEE 2676/90 (determinazione dei metodi comunitari di analisi da utilizzare nel settore del vino) prevede la rivelazione dell’aumento del titolo alcolimetrico di mosti e vini, ottenuto con addizione fraudolenta di saccarosio, mediante analisi NMR del rapporto D/H .

– Regolamento CEE 822/97 (modifica del Regolamento precedente) prevede la determinazione del rapporto isotopico ¹⁸O/1⁶O dell’acqua contenuta nei vini per identificare il possibile fraudolento annacquamento di un vino. 

– Regolamento CE 440/2003 (modifica del Regolamento precedente) prevede la determinazione del rapporto isotopico ¹³C/¹²C dell’etanolo nei vini e nei mosti mediante tecnica IRMS per identificare l’addizione fraudolenta di miscele di saccarosio da bietola e canna.

Qualche esempio: 

Analisi isotopica ¹³C/1²C e D/H su vini sloveni. Dal confronto con vini non adulterati è possibile definire tre aree: una per le adulterazioni con zucchero di canna, una per le adulterazioni con zucchero di bietola e una per le adulterazioni con miscele.

La determinazione del rapporto D/H può fornire indicazioni sull’autenticità di liquori pregiati come il whisky, permettendo di differenziare il whisky da grano o bourbon (il grano è una pianta con cammino biosintetico del tipo C4), il whisky single malt da orzo (pianta C3) e il whisky blended, in cui l’etanolo deriva da una miscela grano-orzo.

Aggiunta di Alcool etilico di sintesi 
La legislazione vieta l’utilizzo di alcool di sintesi nelle bevande alcoliche: 

• L’allegato III del Reg. CEE N. 491/2009del 25/05/2009 relativo all’organizzazione comune dei mercati agricoli definisce il vino come “il prodotto ottenuto esclusivamente dalla fermentazione alcolica totale o parziale di uve fresche, pigiate o no, o di mosti di uve”
• L’art. 2 del Reg. CEE N. 110/2008del 15/01/2008 relativo alla definizione, alla designazione, alla presentazione, all’etichettatura e alla protezione delle indicazioni geografiche delle bevande spiritose (GU CE L 160 del 12/06/1989 stabilisce che le bevande spiritose devono contenere distillati e alcool etilico di origine agricola
• L’art. 3 del Reg. CEE N. 1601/91del 10/06/1991 che stabilisce le regole generali relative alla definizione, alla designazione e alla presentazione dei vini aromatizzati, delle bevande aromatizzate a base di vino e dei cocktail aromatizzati di prodotti vitivinicoli (GU CEE L 149 del 14/06/1991), stabilisce che l’alcool aggiunto deve essere di origine agricola o viticola. 

Questo tipo di frode è meno frequento nei vini, mentre è abbastanza frequente nei superalcolici e nella produzione degli aceti. Qui l’acido acetico ottenuto per ossidazione batterica dell’alcool etilico da fermentazione, viene in parte sostituito con acido acetico proveniente dall’ossidazione dell’alcool etilico sintetico. 

La tecnica di analisi si basa sull’osservazione che esiste una radioattività naturale di fondo dovuta alla presenza di ¹⁴C , che si ripresenta in tutti i prodotti di origine biologica. Mentre i prodotti organici non di origine biologica (origine petrolifera) non presentano questo tipo di radiazione. 

L’alcool etilico di sintesi ha le stesse caratteristiche chimico-fisiche dell’alcool etilico di origine biologica con l’unica differenza che quest’ultimo contiene Carbonio 14 (radioattivo = semivita 5730 anni). Questo perché nel petrolio formatosi milioni di anni fa, per decomposizione di materiale vegetale, il ¹⁴C contenuto in origine è completamente decaduto (radioattività zero).

Quindi se ad un prodotto contenente alcool etilico o suoi derivati provenienti da fermentazione si aggiunge alcool etilico o suoi derivati provenienti da origine petrolifera, la sua radioattività dovuta al ¹⁴C si abbassa proporzionalmente alla quantità aggiunta. 

La Rintracciabilità del Vino 

Per chi vuole approfondire sulle Datazioni Radiattive